< Попер   ЗМІСТ   Наст >

Біохімічні методи

Причиною численних спадкових порушень обміну речовин є різноманітні дефекти ферментів, які виникають унаслідок мутацій відповідних генів. Такі захворювання називають ферментопатіями (ензимопатіями). Найпоширенішими е фенілкетонурія, алкаптонурія, галактоземія, муковісцидоз, хвороба Гоше, хвороба Тея — Сакса, альбінізм та ін. Біохімічні показники (первинний продукт гена, накопичення патологічних метаболітів в організмі хворого) чіткіше відображають сутність хвороби порівняно з клінічними показниками.

Використання хроматографії, електрофорезу, спектроскопії тощо дає змогу визначити будь-які метаболіти, специфічні для конкретної спадкової хвороби.

Хроматографія — це спосіб розділення різних сумішей на складові. Метод полягає в тому, що в нерухомому середовищі, через яке протікає розчинник, кожний компонент, захоплений ним, рухається із певною швидкістю, незалежною від швидкостей інших компонентів. Якщо, наприклад, суміш пігментів, які визначають зелений колір рослини, розчинити в певному розчиннику і пропустити через нерухоме середовище, наприклад через мелену крейду, то вона розділиться на кілька різних пігментів. За таким самим принципом визначають наявність певного ферменту в складній суміші різноманітних речовин організму.

Електрофорез — це модифікація хроматографії, що дає змогу розділити молекули з різними зарядами. У хроматографічному середовищі під дією електричного поля різні молекули суміші рухаються в той чи інший бік залежно від їх відносних мас та зарядів. Електрофорез широко застосовують для виокремлення та ідентифікації амінокислот.

Спектроскопія полягає у визначенні будови молекул різноманітних речовин за допомогою спеціальних приладів — спектроскопів. Залежно від типу приладу спектроскопію здійснюють в ультрафіолетовій, видимій або інфрачервоній частинах спектра. Світло пропускають через досліджувану речовину і аналізують його спектр на виході. Кожний хімічний елемент має характерні лінії у спектрі, тому можна визначити хімічну структуру молекули досліджуваної речовини. У такий спосіб ідентифікують певний фермент чи іншу хімічну сполуку в організмі або визначають будову раніше не відомої речовини.

Об'єктами біохімічних аналізів можуть бути сеча, піт, плазма та клітини крові, культури клітин (фібробласти, лімфоцити).

Біохімічні методивизначення наявності певних речовин (переважно первинних продуктів генів — ферментів та патологічних метаболітів з метою діагностування спадкових хвороб).

Біохімічні методи дуже трудомісткі, потребують спеціального обладнання, тому їх не можна використовувати для масових популяційних досліджень з метою раннього виявлення хворих із спадковою патологією обміну. Останнім часом у різних країнах розробляють і використовують для масових досліджень спеціальні програми. Перший етап такої програми називають скринінгом (англ. screening — просіювання), що полягає у виокремленні серед великої кількості обстежуваних імовірно хворих, які мають певні спадкові відхилення від норми. На цьому етапі звичайно застосовують прості та доступні експрес-методи для виявлення продуктів обміну у сечі, крові. На другому етапі проводять уточнення (підтвердження чи спростування діагнозу) з використанням точних хроматографічних методів визначення ферментів, амінокислот тощо.

Використовують також мікробіологічні тести, які ґрунтуються на тому, що деякі штами бактерій ростуть тільки в середовищах, котрі містять певні амінокислоти, вуглеводи. Якщо у крові або сечі є необхідна для росту речовина, то у чашці Петрі навколо фільтрувального паперу, просоченого однією з цих рідин, спостерігається активне розмноження бактерій, чого не відбувається у разі тестування крові або сечі здорової людини.

Біохімічні методи застосовують також і для виявлення гетерозиготних носіїв спадкових аномалій, які у фенотипі проявляються невиразно. Це роблять за допомогою біохімічного тестування, мікроскопічного дослідження клітин крові та тканин, визначення активності певного ферменту, зміненого внаслідок мутації тощо. Такі заходи необхідні для своєчасного лікування та профілактики, а також визначення вірогідності народження хворої дитини в генетично ризико-вій сім'ї.

Молекулярно-генетичний метод

Аналізувати фрагменти ДНК, знаходити та ізолювати окремі гени і їх сегменти та визначати в них послідовність нуклеотидів дає змогу молекулярно-генетичний метод.

Молекулярно-генетичний методвикористання біохімічних реакцій, які здійснюються за допомогою відповідних ферментів, з метою визначення структури генів, їх ідентифікації та локалізації, а також характеру мутацій.

Цей метод успішно застосовують для ідентифікації генних мутацій, а також вивчення геному людини. Поширився він у 70—80-ті роки XX ст. у зв'язку з розвитком молекулярної генетики.

Початковим етапом молекулярно-генетичного аналізу є одержання достатньої кількості зразків ДНК через клонування. Для цього використовують геномну ДНК — усю ДНК клітини або окремі її фрагменти.

Деспіралізацію, виявлення та вирізання відповідних фрагментів ДНК здійснюють за допомогою особливих ферментів — ресшриктаз. Різні рестриктази розпізнають тільки відповідні послідовності нуклеотидів та розрізають ДНК у визначених місцях. Виокремлені фрагменти ДНК за допомогою спеціальних ферментів — полімераз — копіюють у необхідній кількості.

Копійовані фрагменти ДНК за допомогою електрофорезу на агаровому або поліакридамідному гелі розділяють на фракції за розмірами. Під дією електричного поля фрагменти ДНК рухаються у гелі зі швидкістю, залежною від їх довжини: чим вони коротші, тим швидше рухаються. У результаті цього фрагменти ДНК через деякий час займають певне місце на полосі гелю у вигляді окремих смуг. Довжину кожного фрагмента визначають шляхом порівняння відстаней, пройдених ним, і стандартним відрізком ДНК (із відомими розмірами та послідовністю основ).

Для ідентифікації виокремлених фрагментів ДНК їх спочатку розділяють на два ланцюжки, а потім гібридизують із відповідними маркерними фрагментами ДНК. Якщо при цьому утворюється нормальна подвійна спіраль, то досліджуваний фрагмент не мав порушень. Якщо спіраль має дефекти, то досліджуваний фрагмент є мутантним.

Різні модифікації цього методу дають змогу проаналізувати в лабораторії навіть незначну кількість ДНК, узяту у хворого. їх використовують для пренатальної діагностики спадкових хвороб. При цьому ДНК отримують з ембріональних клітин, які містяться у навколоплідній рідині. Аномальний ембріон легко розпізнати, бо його ДНК гібридизується тільки з маркерним фрагментом ДНК, який має комплементарну мутантну послідовність нуклеотидів.

У 90-ті роки XX ст. за допомогою молекулярно-генетичної методики були ідентифіковані та локалізовані гени, відповідальні за такі важкі спадкові хвороби нервової системи людини, як хорея Гентингтона, міотонічна дистрофія, синдром ламкої Х-хромосоми та ін. Наприклад, ген хореї Гентингтона локалізований у короткому плечі 4-ї хромосоми. Він має ділянку, де нуклеотидна послідовність представлена багаторазовим повторенням трьох основ ЦАГ (цитозин — аденін — гуанін). У нормі кількість таких повторів коливається від 11 до 34, а у хворих унаслідок мутації гена їх 37—86. Хвороба успадковується за аутосомно-домінантним типом, а ознака проявляється в усіх носіїв гена.

На основі молекулярно-генетичного методу нині успішно розробляють технології генної терапії найпоширеніших спадкових хвороб, наприклад муковісцидозу.

 
< Попер   ЗМІСТ   Наст >