Метод генетичних маркерів

У ролі маркерів вибирають структури відомої генетичної природи; білки, хромосомні варіанти, поліморфізм ДНК, моногенні морфологічні ознаки, які повністю контролюються пенетрантними генами. Це, у свою чергу, дає змогу розв'язувати різного роду проблеми, а саме: засвідчити спадкову природу ознаки та встановити її генетичну гетерогенність (наприклад, маркером синдрому Дауна є 21-а хромосома).

Материнський ефект – вплив материнського організму на плід у період внутрішньоутробного розвитку. Проявляється при порівнянні дітей із сімей, у яких матері є монозиготними близнюками (МБ), з тими сім'ями, де монозиготними близнюками є батьки (чоловіки). Такі діти є вільними братами і сестрами, оскільки їх батько чи мати є генетично ідентичними. У цих дітей стільки ж загальних генів, скільки й у вільних братів та сестер, тобто близько 25 %.

У психогенетичних дослідженнях у різних модифікаціях використовують три основні методи: близнюків, прийомних дітей, сімейний.

Р. Кеттеллом розроблено метод аналізу множинної абстрактної дисперсії (MAVA), який забезпечує отримання максимуму надійної інформації при розкладанні фенотипової дисперсії. Цей метод вимагає обстеження 8 типів родин (до 2500 пар дітей), у яких: монозиготні близнюки, виховані разом; монозиготні близнюки, виховані окремо; сибси, виховані разом; сибси, виховані окремо; напівсибси, виховані разом; напівсибси, виховані окремо; неродичі, виховані в одній родині; неродичі, виховані окремо.

Метод близнюків

Цей метод є одним із найбільш ранніх у вивченні генетики людини. Він був запропонований у 1876 р. англійським антропологом і психологом Ф. Гальтоном.

Слід зазначити, що народження близнюків ще двадцять років тому вважалося рідкісним явищем. На кожні сто поодиноко народжених дітей припадала одна двійня, на сотню двієнь – одна трійня, на сотню трієнь – одна четверня тощо. Демографи обчислили, що сьогодні на Землі проживає близько 50 млн пар близнюків. Приблизно одну третину всіх близнюків складають однояйцеві, а дві третини – двояйцеві.

Так, кількість монозиготних близнюків у різних регіонах земної кулі є величиною відносно постійною, з незначними коливаннями. Зокрема, у середньому в США з кожних 60 пологів одні – це двійня. Причому за останні п'ять років кількість двієнь зросла на 28 000. У багатьох країнах світу також реєструють зростання кількості випадків щодо появи багатоплідних вагітностей. Наприклад, в Італії – 0,37 %, в Данії – 0,38 %, у Японії – 0,40%, в США – 0,39 %, в Австралії – 0,38 % відповідно. Як свідчать наведені дані, фактори, що впливають на появу однояйцевих близнюків майже не залежать від умов довкілля.

Частота народження дизиготних близнюків у різних країнах має значні коливання. Наприклад, у Данії – 1,02 %, в Італії – 0,86 %, в США – 0,61 %, в Австралії – 0,77 %, в Японії – 0,23 %, в Південній Африці – 2,23 % відповідно. Таким чином, якщо в Японії на 10 000 народжених близнюків припадає 23 пари двояйцевих, то в Південній Африці – 223. Причини такої різниці невідомі, проте це може свідчити про вплив факторів довкілля. Більшість біологів, лікарів та вчених таке зростання народжуваності близнюків пов'язують з використанням фармпрепаратів для підвищення ймовірності завагітніти жінкам, які страждають на безпліддя. Крім того, альтернативні репродуктивні технології також сприяють зростанню ризику багатоплідної вагітності (наприклад, пересадка одночасно декількох ембріонів після in vitro запліднення).

Частоту народження монозиготних (МБ) та дизиготних близнюків (ДБ) виражають близнюковим коефіцієнтом – кількість близнюкових пар на 1000 пологів.

Для ДБ коефіцієнт дизиготності (d) обчислюють за формулою:

де и – кількість різностатевих близнюкових пар; N – загальна кількість вивчених пологів.

Для МБ коефіцієнт монозиготності (то) обчислюється за формулою:

де L – загальна кількість близнюкових пар серед вивчених пологів; и – кількість різностатевих близнюкових пар; N – загальна кількість серед вивчених пологів.

Тестом на репрезентативність добору є співвідношення моно- та дизиготних близнюків щодо певної відповідності в популяції. Це співвідношення можна легко визначити ще до етапу діагностики, виходячи з принципу В. Вайнберга.

Як відомо, поділ близнюків на дві групи – однояйцеві (монозиготні) та двояйцеві (дизиготні) був запропонований Ф. Гальтоном.

Монозиготні близнюки (МБ) розвиваються із роз'єднаних бластомерів, які утворилися після дроблення однієї заплідненої яйцеклітини і, отже, мають однаковий генотип. МБ при нормальному ембріональному розвитку завжди однієї статі. Здебільшого у них є одна плацента, проте не завжди можна зробити висновок щодо зиготності близнюків на цій підставі. Якщо розподіл відбувається протягом перших п'яти днів після запліднення, то кожний зародок матиме власну плідну оболонку і плаценту. Цей варіант зустрічається приблизно у 25 % однояйцевих близнюків. Якщо розщеплення відбувається на стадії морули (5-12-й день), тоді однояйцеві близнюки матимуть одну плаценту. Якщо ж процес розщеплення запізнюється і відбувається після 13-15-го дня, то найчастіше повного роз'єднання монозиготних близнюків не відбувається і виникають різні вади. Раніше, використовуючи цей метод, порівнювали близнюків за зовнішніми морфологічними ознаками: колір волосся, очей, пігментація шкіри, форма носа, очей, губ, вушних раковин, візерунки пальців тощо, які зумовлені спадково. Якщо досліджувана ознака проявляється у обох близнюків пари, то вони конкордантні. (Конкордантність – відсоток подібності у близнюків за досліджуваною ознакою, відповідно відсутність такої ознаки пов'язують з дискордантністю.)

Для точного визначення зиготності, крім морфологічних ознак, використовують дослідження груп крові (за системою ABO, Rh, MN) і білків плазми крові. Проте за наявності генокопій існує можливість появи іншого типу дискордаyтності. Генетичні фактори у цьому разі не відіграють значної ролі, однак у одного з близнюків виникає генокопія, і ця пара може бути прикладом дискордантності. Ознаки можуть виникати як наслідок певного генотипу, так і впливу факторів довкілля.

Для встановлення ролі негенетичних факторів природи конкордантності та дискордантності рекомендують використовувати метод сімей близнюків. У разі, коли йдеться про хвороби, то порівнюють показники захворюваності у родичів конкордантних і дискордантних пар близнюків. Запропонований метод також використовують для з'ясування материнського ефекту, тобто впливу матері на фенотип нащадків. В основі цього явища лежить цитоплазматична спадковість.

Метод близнюків використовується у генетиці людини для оцінки впливу спадковості та факторів довкілля на розвиток нормальної або патологічної ознаки. Оскільки у монозиготних близнюків однакові генотипи, то наявні відмінності можуть бути викликані впливом факторів довкілля в період як внутрішньоутробного розвитку, так і після народження під час формування організму. Якщо ж ознака формується під впливом факторів довкілля, то різниця (дискордантність) між монозиготами і дизиготами буде незначною. Якщо ознака залежить від генотипу, то схожість між монозиготами буде більшою порівняно з дизиготами. За цим принципом була встановлена генетична схильність до різних хвороб. Відомо, що деякі інфекційні хвороби (поліомієліт, туберкульоз), хоч і викликаються факторами вірусної або бактеріальної природи, однак їх прояв здебільшого залежить від спадкової схильності.

Для оцінки ролі спадковості у розвитку тієї чи іншої ознаки здійснюють обчислення за формулою:

де Н – коефіцієнт спадковості; МБ – моно- і ДБ – дизиготні близнюки.

При Н = 1 – ознака визначається спадковим компонентом; при H = 0– значну роль відіграє вплив довкілля. Коефіцієнт, близький до 0,5, свідчить про однаковий вплив як спадковості, так і факторів довкілля щодо прояву ознаки. Дизиготні близнюки з генетичної точки зору також є близькими, як і звичайні діти одних і тих же батьків, в яких загальними є близько 50 % генів. На відміну від МБ, ДБ можуть бути різностатевими. Загалом можуть зустрічатися ДБ вільних братів і сестер, які мають тільки 25 % загальних генів.

Якщо в період овуляції жінка мала статеві зв'язки з різними партнерами, то у такому разі яйцеклітини можуть бути запліднені сперматозоїдами різних батьків. Таким чином, близнюкові пари матимуть різних батьків. Такі випадки трапляються досить рідко й виявляються у процесі судових експертиз щодо визначення батьківства.

Дизиготні близнюки виникають внаслідок одночасного запліднення двох чи більше яйцеклітин. Це може відбутися завдяки одночасному утворенню двох яйцеклітин у двох фолікулах або внаслідок того, що друге редукційне тільце такого ж розміру, як і нормальна яйцеклітина. ДБ – сибси (брати чи сестри), але народились в один час, і мають 50 % загальних генів. МБ завжди однієї статі, а ДБ можуть бути як однієї статі, так і різностатевими. Якщо близнюки різностатеві, то, природно, вони дизиготні, якщо ж однієї статі, то диференціювати монозиготних і дизиготних близнюків досить складно. Двояйцевих близнюків частіше народжують жінки у віці 40-45 років, а також ті, що пройшли лікування гонадотропними гормонами. Схильність до народження таких близнюків передається за материнською лінією. З генетичної точки зору МБ цілком ідентичні. Частота народження МБ становить близько 4 випадків на 1000, і цей показник є досить стабільним у різних популяціях.

Одним із варіантів методу близнюків є метод розлучених близнюків, що дозволяє відокремити генотипову подібність від фенотипової. У разі, коли між МБ реєструються певні відмінності у фенотипі, то вважається, що вони можуть бути пов'язані з різним впливом факторів довкілля (оскільки їхні генотипи абсолютно ідентичні). Таким чином цей метод дає можливість оцінити, насамперед, вплив різних умов середовища на однакові генотипи. Під час дослідження порівнюють подібність МБ, які виросли разом, з близнюками, розлученими після народження, або ж які зростали в різних умовах проживання. Слід зауважити, що добір таких пар є досить складним, оскільки повне розлучення близнюків у суспільстві трапляється досить рідко. Інформацію про найбільшу кількість цих груп зібрали X. Ньюмен з колегами, Д. Шилдс та Н. Жуел-Нільсон.

Суть методу полягає у вивченні членів монозиготних пар (МЗ-пар), що були розлучені в ранньому дитинстві й виросли в різних умовах. Дослідження доповнюють зіставленням із внутріпарною подібністю МБ, що виросли разом, а також ДБ і сибсів. Доведено, що розлучені МБ за низкою ознак, зокрема і психологічних, виявляють внутріпарну подібність, хоч і дещо меншу, ніж МЗ, які виросли разом, але більшу, ніж ДБ (що теж виросли разом). При цьому важливо об'єктивно оцінити відмінності умов середовища, в яких виховували близнят однієї пари.

Датський психогенетик Н. Жуел-Нільсон, досліджуючи 12 пар розлучених монозиготних близнюків, продемонстрував усі ступені внутріпарної подібності – від високої в експресивних рисах (міміці, голосі, ході тощо) до дуже низької у вузькоспеціалізованих (стилі міжособистісної взаємодії, інтереси та ін.). Це дослідження є зразком детального психологічного аналізу (воно наближене до вказаного методу вивчення дорослих близнюків, що тривалий час живуть нарізно, мають різні професії, різний життєвий досвід тощо).

Автором методу близнюкової пари є французький психолог Р. Заззо (1910-1961). Суть цього методу полягає у вивченні специфіки психологічних стосунків близнюків. Р. Заззо довів, що близнюкова пара часто утворює свій мікросвіт, який характеризується певними особливостями внутрішніх взаємин і відносин із довкіллям. Ці особливості помітно позначаються на психологічній індивідуальності кожного з них. Наприклад, про відставання близнюків однієї пари у мовному розвитку, спричинене їх "замкнутістю один на одному", свідчать і інші науковці. Такі дослідження допомагають глибше з'ясувати основний постулат близнюкового методу щодо однаковості зовнішніх впливів для МБ- та ДБ-пар і для кожного з близнюків однієї пари зокрема тощо. Крім того, більша подібність МБ порівняно з ДБ у деяких випадках може пояснюватися не їхньою генетичною ідентичністю, а особливими умовами середовища, сформованого всередині пари. Отже, у такому разі робити висновок щодо спадкової зумовленості ознаки не можна.

Іншим варіантом методу близнюків є метод близнюкових сімей. Фактично йдеться про суміщення близнюкового та сімейного методів. Такий різновид досліджень дозволяє вивчати генокопії, тобто неспадкові зміни фенотипу організму, за яких у фенотипі внаслідок впливу факторів довкілля розвиваються ознаки, пов'язані з певним геном або набором генів. Наявність генокопій ускладнює аналіз, оскільки одна і та ж ознака може проявлятися як наслідок певного генотипу, а також виникати в результаті специфічної дії зовнішнього середовища. При близнюковому аналізі випадки дискордантності зумовлені будь-якими чинниками довкілля. Наприклад, коли спостерігається генетична схильність, проте вплив факторів навколишнього середовища не дозволяє їй проявитися і, як наслідок, один із близнюків хворіє, а інший ні.

Для визначення впливу різних чинників довкілля на розвиток тієї чи іншої ознаки в експериментальних дослідженнях використовують метод контрольних близнюків (метод близнюка-свідка, взаємоконтролю близнюків, контролю за партнером). В експериментальну та контрольну групи входять по одному із близнюків з кожної пари. Якщо ж один із них зазнає впливу певного чинника, то інший є контролем. Таким чином можна оцінити дію фактору на мінливість ознаки. Метод контрольного близнюка запропонував американський вчений А.-Л. Гезелл (1880-1961). Для експериментів добирали особливо схожі МЗ-пари, а потім на одного близнюка здійснювали зовнішній вплив (наприклад, тренували певну функцію), а на іншого ні. При цьому останній ставав ідеальною "контрольною групою".

Отже, у пре- і постнатальних середовищних умовах розвитку близнюків виокремлюють чинники, які роблять середовище МБ внутріпарно більш схожим, ніж у ДБ, підвищуючи подібність перших за рахунок негенетичних впливів, а отже, призводять до помилкового завищення оцінок успадкованості.

Метод усиновлених дітей дозволяє з'ясувати, що найбільше впливає на розвиток ознак – генетична схильність чи дія факторів довкілля. В основі методу є порівняння схожості з біологічними та всиновленими батьками. Схожість з біологічними батьками пояснюється генетичним впливом, з усиновленими – дією факторів довкілля. Отже, цей метод використовують для перевірки ефективності терапевтичних заходів при різних захворюваннях, а також при вивченні експресивності та пенетрантності генів, які спричиняють спадкові хвороби. Крім того, він надає цінну інформацію щодо вивчення морфологічних і фізіологічних ознак, ролі генотипу та модифікації у формуванні обміну речовин у людини тощо.

Цитогенетичний метод полягає у дослідженні структури і кількості хромосом у клітинах людського організму. Принципи цитогенетичних досліджень були сформовані у 20-30-х роках XX ст. на класичному об'єкті генетики – дрозофілі та деяких рослинах. Цитогенетичний метод (метод хромосомного аналізу) дозволяє записувати діагноз спадкового захворювання у вигляді каріотипічної формули.

Відомо, що хромосомний набір людини містить велику кількість хромосом, основні відомості про які можна одержати при їх вивченні у метафазі мітозу й профазі – метафазі мейозу. Клітини людини для прямого хромосомного аналізу отримують шляхом біопсії кісткового мозку і гонад або непрямим методом – через культивування клітин периферичної крові (лімфоцити), коли отримують значну кількість метафаз. Цитогенетичний метод використовують для: вивчення каріотипів організмів; уточнення числа хромосомних наборів, кількості та морфології хромосом для діагностики хромосомних хвороб; складання карт хромосом; вивчення геномного і хромосомного мутаційних процесів; вивчення хромосомного поліморфізму в людських популяціях. До стандартних цитогенетичних методів належать: ФТА – культивування лімфоцитів; диференційне забарвлення хромосом; NOR – фарбування ядерце-утворювальних ділянок акроцентричних хромосом.

Біохімічні методи. Біохімічні методи застосовуються для діагностики хвороб обміну речовин, причиною яких є зміни активності окремих ферментів. Відомо понад 1000 спадкових захворювань, зумовлених дефектами обміну речовин. За допомогою біохімічних методів відкрито близько 5 000 молекулярних хвороб, які є наслідком прояву мутантних генів. При різних типах захворювання вдається визначити сам аномальний білок – фермент або проміжні продукти обміну. Спадкові дефекти обміну речовин біохімічно можуть бути діагностовані за допомогою визначення структури аномального білка (структурних білків або ферментів, таких як аномальні гемоглобіни, несправжня холінестераза); проміжних продуктів обміну, які виникають унаслідок генетичного блоку прямої реакції обміну. Це найбільш поширений метод діагностики різних ензимопатій.

Згідно з класифікацією ВООЗ, спадкові дефекти обміну поділяються на порушення: амінокислотного обміну; вуглеводного обміну; ліпідного обміну; стероїдного обміну; пуринового і піримідинового обмінів; аномалії обміну металів. Для вивчення ферментативних порушень використовують методи ензимології. Причому важливе значення мають як кількісні зміни активності ферменту, так і якісні відмінності у функціонуванні нормального та зміненого ферменту.

Біохімічні методи використовують у разі підозри на спадкові хвороби обміну речовин та інші форми з точно встановленим дефектом. До того ж вони дозволяють виявити нестачу певних сполук або надлишок їх попередників. До біохімічних методів належать перш за все хроматографічні методи (хроматографія на папері, іонообмінних смолах, у тонких шарах, газорідинна хроматографія, методи електрофорезу, імуноелектрофорезу та ін.). Крім того, їх використовують з метою діагностики гетерозиготних станів у дорослих та в медико-генетичному консультуванні для встановлення ризику народження хворої дитини. Раніше вдавалося діагностувати близько 10-15 гетерозиготних станів, сьогодні – понад 200. Виявлення гетерозиготних носіїв будь-якого захворювання можливе шляхом використання біохімічних тестів (фенілаланіну – для виявлення фенілкетонурії, цукру – для виявлення цукрового діабету), мікроскопічного дослідження клітин крові та тканин, визначення активності ферменту, зміненого внаслідок мутагенних факторів фізичного, хімічного чи біологічного походження.

Відомо, щозахворювання, викликані порушенням обміну речовин, складають значну частину спадкової патології (фенілкетонурія, галактоземія, алкаптонурія, альбінізм). Так, гетерозиготні носії фенілкетонурії реагують на введення фенілаланіну у високих концентраціях амінокислоти в плазмі, порівняно з нормальними гомозиготами (хвороба зумовлена рецесивним алелем). Відомо, що серед здорових людей завжди трапляється значна кількість носіїв патологічного гена. Незважаючи на те, що такі люди ззовні виглядають здоровими, однак ймовірність появи захворювань у їхніх дітей завжди існує. У зв'язку з цим виявлення гетерозиготного носія – одне з важливих завдань медичної генетики. Наприклад, якщо одружуються гетерозиготні носії будь-якого захворювання, то ризик появи хворої дитини в такій сім'ї становить 25 %. Можливість зустрічі двох носіїв однакового патологічного гена є високою у тому разі, коли шлюб беруть родичі, оскільки вони можуть успадкувати один і той же рецесивний ген від свого загального предка. Виявити гетерозиготного носія у жінки можливо, якщо: її батько має схильність до спадкових хвороб: у жінки народилися хворі сини; жінка має хворого брата чи братів; у двох доньок жінки народилися хворі сини чи один син; у здорових батьків народився хворий син, а в родоводі матері є хворі чоловіки.